Eigentlich könnte alles wunderbar laufen für Peter Parker (Tobey Maguire), seit er seiner Freundin Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) seine Geheimidentität "Spiderman" offenbart hat. Doch am Horizont zeigen sich bald neue dunkle Wolken, als der Ausbrecher Flint Marko (Thomas Hayden Church) durch einen Unfall in den geheimnisvollen "Sandman" verwandelt wird, einen Mutanten, der seine Moleküle verändern kann. Peter ist bald persönlich betroffen, denn offenbar hat Marko etwas mit dem Mord an seinem Onkel zu tun. Doch es zeigt sich neues Unheil: eine außerirdische schwarze Substanz ergreift von Peter Besitz, die seine dunkle, machtstrebende Seite zum Vorschein bringt. Parker vergißt bald seinen guten Charakter und wendet sich einer hübschen Kollegin im Büro, Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard) zu. Das wiederum macht ihren Freund Eddie Brock (Topher Grace) eifersüchtig, der, als Peter den Symbionten endlich los wird, von diesem in Besitz genommen wird. Ein neuer Supergegner, Venom, ist damit geboren. Und als sei das nicht genug, tritt Peters alter Freund und neuer Todfeind Harry Osborn (James Franco) in die Fußstapfen seines verstorbenen Vaters und wird zum "Green Goblin" - das Triumvirat von Spidermans Gegnern ist komplett...